并于1991年获得诺贝尔化学奖

核磁共振(NMR)作为一种重要波谱分析手段，核磁广泛应用于医学、共振药学、波谱化学、药物应用生物学、领域食品以及材料科学等诸多学科领域。核磁核磁共振波谱能提供复杂体系中分子结构、共振相互作用、波谱动态过程和含量等大量信息，药物应用在药学领域中发挥着十分重要的领域作用。本文综述了近10年来核磁共振波谱技术在药物发现、核磁药物和药用辅料质量控制、共振化学药品标准物质研制和药物代谢研究等方面的波谱应用。

核磁共振（NMR）是药物应用自旋量子数不为零的原子核在外磁场作用下能级发生塞曼分裂，共振吸收某一特定频率的领域射频辐射，从低能态跃迁到高能态的物理过程。NMR就是利用该物理现象探测处于不同化学环境下的原子核而获取的信息来研究物质分子结构、化学组成、分子间相互作用等内容的光谱学方法。自1946年美国斯坦福大学的Bloch和哈佛大学的Purcell领导的研究团队分别发现水和石蜡中的NMR信号之后，NMR技术在短短几十年里得到快速的发展。最初的NMR仪器使用的是电磁铁或永久磁铁的连续波（CW),20世纪70年代Ernst发展了脉冲傅里叶变换（FT）的方法，将NMR仪器和技术推向一个新的高度，并于1991年获得诺贝尔化学奖。1985年，瑞士科学家Wüthrich教授将NMR应用于蛋白质的结构解析，从而推动了NMR在生物学领域的应用，Wüthrich也因此获得2002年诺贝尔化学奖。20世纪90年代，超高场NMR谱仪的问世，极大地提高了NMR检测的灵敏度和分辨率，推动NMR在各个领域更加广泛的应用。

NMR作为一种重要波谱分析手段，可深入探测物质内部结构而不破坏样品，并具有准确、快速和对复杂样品不需要预处理就能进行分析等特点。随着磁场强度的提高，信号检测（硬件和信号处理）、脉冲实验、自旋标记等技术的进步，困扰NMR低灵敏度的问题已大大改善。如今，NMR已广泛应用于医学、药学、化学、生物学、食品以及材料科学等诸多学科领域，成为这些领域常规工作以及科学研究的有力工具，在某些领域甚至已经成为一种不可或缺的分析与测量手段。本文综述了NMR在药物发现、药物和药用辅料质量控制、药品标准物质研制和药物代谢研究等方面的应用，并对其应用前景进行展望。

1 NMR在药物发现中的应用

近20年来，得益于方法和仪器上的进步，NMR已经成为药物发现的主要工具：可以为药物发现提供许多重要信息，如结合位点的识别和确定、药物设计等。基于片段的药物发现（fragment-based drug discovery,FBDD）是近年来发现先导化合物的主流方法之一，而NMR是第1个被成功应用于片段筛选的技术。在药物发现阶段，利用NMR进行活性化合物筛选的方法可以分为蛋白筛选法和配体筛选法。蛋白筛选法是通过配体小分子与蛋白质结合后，蛋白质结合位点的局部化学环境会发生改变，检测生物靶分子的化学位移的变化来实现的。其方法主要有核磁共振构效关系（structure-activity relationship by NMR,SAR-by-NMR）研究法和基于G-四链体识别法。SAR-by-NMR方法是利用15N标记的蛋白质和15N-1H HSQC实验来实现的。通过15N-1H HSQC谱中15N或1H的化学位移的变化可以检测到是否有小分子和蛋白结合，同时配体和蛋白质的结合常数可以通过化学位移的变化和配体浓度的关系测得，结合位点也可以由发生化学位移变化的原子核来确定。基于G-四链体的药物筛选方法是在小分子配体中引入G-四链体，利用1H NMR谱中G-四链体亚氨基质子化学位移的变化判断与其结合配体的存在，利用扩散谱（DOSY）对G-四链体配体进行虚拟分离，利用异核单量子相关谱（HSQC）和异核多键相关谱（HMBC）等二维谱进行结构鉴定，得到活性化合物的结构。蛋白筛选法具有很好的稳定性和灵敏度，但是需要对蛋白进行大量的同位素标记。配体筛选法主要是利用特定NMR技术筛选出与靶蛋白结合核磁谱图发生变化的活性小分子。其筛选方法主要有2类：基于流体力学性质（如扩散和弛豫）变化的方法和基于矢量转移的方法。前者是利用小分子与靶标蛋白结合时NMR谱峰会变宽变弱来进行筛选，后者是通过选择性照射蛋白质的质子，由于分子间相互作用磁化强度传递到与蛋白质结合的小分子上，使其信号部分被饱和，利用照射前后核磁的差谱图可以发现与蛋白结合的小分子。例如，Wan等利用配体筛选方法，在中药何首乌初提物中加入与糖尿病、动脉粥样硬化等代谢疾病相关的靶蛋白FABP4，通过检测加入蛋白前后配体NMR信号变化，发现了活性分子2,4-二羟基-6-苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（TSG）。配体筛选法不需要大量的蛋白，也不需要同位素标记，一维NMR谱基本能完成，节省费用和时间，但缺点是无法获取配体与蛋白结合位点的信息。

2 NMR在药物质量控制中的应用

NMR在药物质量控制中的应用主要包括活性药物成分的定性鉴别、含量测定以及杂质检查等等。NMR集定性和定量测定于一体，在药物质量控制中的应用日益广泛。《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2010年版、《美国药典》19版（1975年）、《英国药典》1975年版、《欧洲药典》第5版（2004年）和《日本药局方》12版（1991年）就开始将NMR收载其中。目前，除《中国药典》外，上述国家药典均收载有利用NMR对药物进行质量控制的标准各论。

2.1药物的定性鉴别

NMR能够提供有机化合物丰富的结构信息，是获取有机分子结构确凿证据最常用的方法。既可以用于单一成分的结构鉴定，也可以用于混合物的结构鉴定。特别是一些复杂的聚合物类药物，结构中含有数目不定的重复单元和取代基，且结构及性质相似，常规的检测方法难以对其精细化结构细微差异进行识别，从而无法实现准确区分，NMR谱图与有机分子的化学结构息息相关，能准确反映有机分子结构差异，相对其他理化鉴别方法，NMR对于上述复杂成分的鉴别更具优势。低分子肝素主要是由未分级肝素（unfractional heparin,UFH）为原料，采用不同的降解工艺（自由基降解、亚硝酸降解、β-消除法和酶解法）降解得到的结构不同的肝素衍生物。目前国内外已有多种低分子肝素产品相继问世，按照生产工艺的不同，常见的有依诺肝素钠、达肝素钠、那屈肝素钙、帕肝素钠和汀肝素钠等。分子结构主要由2种糖醛酸（L-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖醛酸）和1种葡萄糖胺以及它们的衍生物（乙酰化、硫酸化）组成的具有不同链长的多糖混合物。为了对不同低分子肝素品种进行有效鉴别，现行的《美国药典》、《欧洲药典》、《英国药典》等除利用分子量与分子量分布、抗Xa因子与抗Ⅱa因子效价比值鉴别外，还增加了核磁共振碳谱（13C NMR）（样品与对照品的碳谱比较两者相似）或氢谱（1H NMR）（样品的氢谱在规定化学位移处出现特征峰信号）的方法进行鉴别。此外，文献也有利用NMR对不同低分子肝素品种进行鉴别的报道。例如，张琪等通过比较依诺肝素钠、达肝素钠、那屈肝素钙、帕肝素钠和汀肝素钠等5种低分子量肝素的13C NMR谱精细结构信息，发现不同类型低分子量肝素的特征碳谱信号，从而实现对其进行鉴别和区分。

2.2药物的含量测定

早在1963年，Jungnickel和Hollis最早报道了定量核磁共振（q NMR）的应用。由于q NMR在有机物含量测定方面具有诸多优势，譬如定量时定量峰面积只与它的原子数有关，因此不需要引进任何校正因子；不需要待测物相应的标准物质；供试溶液制备方便；实验操作简单、分析速度快等等，因而q NMR在药物含量测定方面得到越来越多的应用。目前，q NMR用于定量最多的是定量1H、19F和31P NMR谱；定量方法有内标法（待测物和内标物同时置于同一核磁管中进行测定）和外标法（待测物和内标物分别置于2支核磁管分别测定），现在多使用内标法；定量模式分绝对定量和相对定量2种模式，前者采用标准物质，直接检测待测样品中的组分含量，后者是基于待测样品中每个组分特征峰的积分值，检测特定组分之间的相对含量。在药物含量测定应用过程中，对于分子结构中无发色团不具紫外吸收或者无相应对照品的药物含量测定，q NMR往往是一种非常适宜的方法。例如，阿仑磷酸钠不具紫外吸收，分子极性大，采用滴定法专属性不强，采用常规色谱定量方法则需要进行柱前或者柱后衍生，测定过程复杂，操作烦琐。Xie等采用定量核磁共振氢谱（q HNMR）法，以4-氨基丁酸作为定量内标物，实现对阿仑磷酸钠片中主成分含量的快速测定。Gadape等以DMSO-d6为溶剂，马来酸为定量内标物，对卡维地洛的含量进行测定，并将q NMR法与高效液相色谱（HPLC）法的测定结果比较，无显著性差异，且前者定量准确，无破坏性，适合卡维地洛的含量测定。q NMR作为一种定量方法使用日益广泛，利用该法进行含量测定时，除对影响定量准确性的因素如样品的称量、待测物和内标物的浓度和定量峰的选择、采集时间、扫描次数、弛豫延迟时间（D1）的设置等应注意外，还应对待测物与内标物是否发生反应、定量峰是否包含有其他峰等因素加以关注。

2.3药物杂质的检查

随着公众和媒体对药物安全性的日益关注，对药物中杂质的控制已经成为药品质量控制的重要环节。药品中诸杂质的种类和含量被总称为杂质谱。反相高效液相色谱法是目前药品杂质谱分离分析的主要方法，随着NMR技术的发展，NMR已经成为解决杂质谱定性和定量诸多挑战的重要的有效工具。特别是NMR法可以对一些药物的多种杂质成分同时进行定性和定量分析，而无需复杂的前期分离处理。液相色谱质谱联用（LC-MS）能够对杂质混合物进行结构鉴定，但是存在有些情况下不能得到确切无疑的结构信息，无法区分异构体等缺点，此时NMR及其联用技术能够提供最全面的结构信息，包括化合物的平面结构、相对结构和立体结构，从而在杂质分析方面发挥重要作用。此外，药物研发的早期阶段，药物中杂质往往没有相应的对照品、对照品的量有限、对照品的含量值不易测定等难点，这些因素会导致杂质分析十分困难。由于NMR无需待测物对照品，因此特别适合药物研发早期阶段。特别是当药品中杂质结构与活性药物成分无直接相关或者杂质结构较为复杂时，一般分析方法对其结构鉴定较为困难，而NMR则往往能够很好地予以解决。因此，对于药品中杂质分析，无论是定性还是定量方面，NMR都能够发挥重要作用。2007年—2008年，欧美各国发生肝素钠注射液由于多硫酸软骨素（OSCS）污染导致上百人死亡的严重药害事件，污染物OSCS结构的最终确认主要是通过一维NMR(1H和13C NMR）和二维NMR实现的。随后，美国FDA将NMR作为肝素中OSCS污染物筛查的重要方法。羧甲司坦是一种祛痰药，目前《欧洲药典》中采用薄层色谱法（TLC）对其中氨基酸杂质进行检测，其方法未能覆盖其他类型杂质如合成起始原料杂质以及降解杂质等，且方法灵敏度不高。Wahl等采用高效液相色谱电喷雾检测器法（HPLC-CAD）、紫外-可见分光光度法和q NMR对羧甲司坦的杂质谱进行了研究，结果发现羧甲司坦中挥发性杂质氯乙酸不适合HPLC检测，但采用q NMR能够准确测定其含量（0.09%），并且该法简便快速。

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